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細(xì)胞基因編輯服務(wù)

細(xì)胞基因編輯服務(wù)

簡要描述:
細(xì)胞基因編輯服務(wù):基因編輯技術(shù)在細(xì)胞層面的應(yīng)用(如腫瘤細(xì)胞系、原代細(xì)胞、iPSCs等)是研究基因功能、疾病機(jī)制和藥物篩選的核心手段

更新時間:2025-06-26

訪問量:41

廠商性質(zhì):其他

一、細(xì)胞基因編輯服務(wù)選擇與適用場景

技術(shù)編輯類型效率適用場景
CRISPR-Cas9敲除/短片段插入基因KO、報告基因敲入
堿基編輯(ABE/BE)單堿基轉(zhuǎn)換SNP糾正(如C→T或A→G)
Prime Editing精準(zhǔn)插入/缺失低-中復(fù)雜突變(無需DSB)
CRISPRa/i基因激活/抑制-表觀調(diào)控研究

二、細(xì)胞基因編輯服務(wù)CRISPR-Cas9基因敲除(KO)流程

1. gRNA設(shè)計
  • 工具推薦

    • CHOPCHOP

    • Benchling

  • 設(shè)計原則

    • 靶向s個編碼外顯子(確保移碼突變)。

    • 避免脫靶(使用CRISPRoff預(yù)測)。

2. 載體選擇
  • 質(zhì)粒系統(tǒng)

    • lentiCRISPRv2(帶Puromycin抗性)。

  • RNP系統(tǒng)

    • Cas9蛋白 + sgRNA(高編輯效率,低脫靶)。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)
細(xì)胞類型遞送方法條件
HEK293T脂質(zhì)體(Lipo3000)70%密度,24h后換液
原代T細(xì)胞電轉(zhuǎn)(Neon系統(tǒng))1600V, 10ms, 3 pulses
iPSCs慢病毒(低MOI)加Polybrene(8 μg/mL)
4. 篩選與驗證
  • 抗生素篩選

    • Puromycin(1-5 μg/mL,48-72h)。

  • 基因型鑒定

    • T7E1/Surveyor assay:快速檢測Indel。

    • Sanger測序:TA克隆后分析突變類型。

  • 功能驗證

    • Western blot(蛋白水平敲除)。


三、基因敲入(KI)與點突變(PM)

1. HDR介導(dǎo)的敲入
  • 供體設(shè)計

    • ssODN(100-200 nt):同源臂40-60 nt + 插入序列。

    • 質(zhì)粒供體:需1 kb同源臂(適合大片段插入)。

  • 增強(qiáng)HDR

    • 添加RS-1(終濃度7.5 μM)或NU7026(DNA-PK抑制劑)。

2. 堿基編輯(C→T或A→G)
  • 系統(tǒng)選擇

    • BE4max(C→T):窗口位點4-8。

    • ABE8e(A→G):窗口位點4-7。

  • 轉(zhuǎn)染條件

    • 質(zhì)?;騌NP(72h后檢測效率)。

3. Prime Editing
  • PE2/PE3系統(tǒng)

    • pegRNA設(shè)計需包含RT模板和PBS序列(使用PE-Designer)。


四、原代細(xì)胞與難轉(zhuǎn)染細(xì)胞優(yōu)化

挑戰(zhàn)解決方案
低轉(zhuǎn)染效率電轉(zhuǎn)優(yōu)化(如原代B細(xì)胞用Amaxa Nucleofector)
高毒性使用RNP(比質(zhì)粒更溫和)
克隆形成率低流式分選(GFP報告系統(tǒng))或有限稀釋法

五、質(zhì)量控制與脫靶分析

1. 編輯效率檢測
  • NGS:擴(kuò)增靶位點后深度測序(>10,000X)。

  • 流式細(xì)胞術(shù):若插入報告基因(如GFP)。

2. 脫靶評估
  • 預(yù)測工具

    • COSMID

  • 實驗驗證

    • 全基因組測序(WGS)或GUIDE-seq。


六、經(jīng)典應(yīng)用案例

編輯類型應(yīng)用案例
TP53 KO腫瘤細(xì)胞增殖研究驗證p53在化療耐藥中的作用
BCL11A增強(qiáng)子編輯胎兒血紅蛋白再激活鐮刀型貧血治療研究
ROS1 G2032R KI靶向藥物耐藥模型克唑替尼耐藥機(jī)制探索


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