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細(xì)胞基因編輯服務(wù)
簡要描述:
細(xì)胞基因編輯服務(wù):基因編輯技術(shù)在細(xì)胞層面的應(yīng)用(如腫瘤細(xì)胞系、原代細(xì)胞、iPSCs等)是研究基因功能、疾病機(jī)制和藥物篩選的核心手段
更新時間:2025-06-26
訪問量:41
廠商性質(zhì):其他
一、細(xì)胞基因編輯服務(wù)選擇與適用場景
技術(shù) | 編輯類型 | 效率 | 適用場景 |
---|---|---|---|
CRISPR-Cas9 | 敲除/短片段插入 | 高 | 基因KO、報告基因敲入 |
堿基編輯(ABE/BE) | 單堿基轉(zhuǎn)換 | 中 | SNP糾正(如C→T或A→G) |
Prime Editing | 精準(zhǔn)插入/缺失 | 低-中 | 復(fù)雜突變(無需DSB) |
CRISPRa/i | 基因激活/抑制 | - | 表觀調(diào)控研究 |
二、細(xì)胞基因編輯服務(wù)CRISPR-Cas9基因敲除(KO)流程
1. gRNA設(shè)計
工具推薦:
CHOPCHOP
Benchling
設(shè)計原則:
靶向s個編碼外顯子(確保移碼突變)。
避免脫靶(使用CRISPRoff預(yù)測)。
2. 載體選擇
質(zhì)粒系統(tǒng):
lentiCRISPRv2(帶Puromycin抗性)。
RNP系統(tǒng):
Cas9蛋白 + sgRNA(高編輯效率,低脫靶)。
3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)
細(xì)胞類型 | 遞送方法 | 條件 |
---|---|---|
HEK293T | 脂質(zhì)體(Lipo3000) | 70%密度,24h后換液 |
原代T細(xì)胞 | 電轉(zhuǎn)(Neon系統(tǒng)) | 1600V, 10ms, 3 pulses |
iPSCs | 慢病毒(低MOI) | 加Polybrene(8 μg/mL) |
4. 篩選與驗證
抗生素篩選:
Puromycin(1-5 μg/mL,48-72h)。
基因型鑒定:
T7E1/Surveyor assay:快速檢測Indel。
Sanger測序:TA克隆后分析突變類型。
功能驗證:
Western blot(蛋白水平敲除)。
三、基因敲入(KI)與點突變(PM)
1. HDR介導(dǎo)的敲入
供體設(shè)計:
ssODN(100-200 nt):同源臂40-60 nt + 插入序列。
質(zhì)粒供體:需1 kb同源臂(適合大片段插入)。
增強(qiáng)HDR:
添加RS-1(終濃度7.5 μM)或NU7026(DNA-PK抑制劑)。
2. 堿基編輯(C→T或A→G)
系統(tǒng)選擇:
BE4max(C→T):窗口位點4-8。
ABE8e(A→G):窗口位點4-7。
轉(zhuǎn)染條件:
質(zhì)?;騌NP(72h后檢測效率)。
3. Prime Editing
PE2/PE3系統(tǒng):
pegRNA設(shè)計需包含RT模板和PBS序列(使用PE-Designer)。
四、原代細(xì)胞與難轉(zhuǎn)染細(xì)胞優(yōu)化
挑戰(zhàn) | 解決方案 |
---|---|
低轉(zhuǎn)染效率 | 電轉(zhuǎn)優(yōu)化(如原代B細(xì)胞用Amaxa Nucleofector) |
高毒性 | 使用RNP(比質(zhì)粒更溫和) |
克隆形成率低 | 流式分選(GFP報告系統(tǒng))或有限稀釋法 |
五、質(zhì)量控制與脫靶分析
1. 編輯效率檢測
NGS:擴(kuò)增靶位點后深度測序(>10,000X)。
流式細(xì)胞術(shù):若插入報告基因(如GFP)。
2. 脫靶評估
預(yù)測工具:
COSMID
實驗驗證:
全基因組測序(WGS)或GUIDE-seq。
六、經(jīng)典應(yīng)用案例
編輯類型 | 應(yīng)用 | 案例 |
---|---|---|
TP53 KO | 腫瘤細(xì)胞增殖研究 | 驗證p53在化療耐藥中的作用 |
BCL11A增強(qiáng)子編輯 | 胎兒血紅蛋白再激活 | 鐮刀型貧血治療研究 |
ROS1 G2032R KI | 靶向藥物耐藥模型 | 克唑替尼耐藥機(jī)制探索 |
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