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cKI小鼠模型構建

cKI小鼠模型構建

簡要描述:
cKI小鼠模型構建:構建 cKI(條件性基因敲入,Conditional Knock-In)小鼠模型 是研究基因功能、疾病機制或藥物靶點驗證的重要工具,尤其適用于需要在特定組織(如心臟)或時間點精確調控基因表達的研究

更新時間:2025-06-26

訪問量:33

廠商性質:其他

1. cKI小鼠模型構建策略選擇

A. 核心元件設計

  1. 目標基因(GOI, Gene of Interest)

    • 將外源基因(如報告基因、突變基因或熒光蛋白)插入內源基因位點,或替換特定外顯子。

  2. 條件性調控系統

    • Cre-loxP系統:通過組織特異性Cre重組酶實現條件性激活。

    • FLEx(Flip-Excision)系統:結合Flp-FRT和Cre-loxP實現多重調控。

    • 誘導型系統(如Tet-on/off、他莫xi芬誘導的Cre-ERT2)。

B. 心臟特異性cKI常用工具

  • 啟動子:αMHC(Myh6)、cT*T(Tnnt2)驅動Cre表達。

  • 報告基因:如tdTomato(loxP-stop-loxP-tdTomato)用于追蹤表達。


2. cKI小鼠模型構建技術流程

A. 載體設計

  1. 靶位點選擇

    • 安全港位點(如Rosa26、H11)或內源基因位點(需同源重組)。

    • 避免干擾鄰近基因(需UCSC基因組瀏覽器分析)。

  2. 條件性敲入結構(以Rosa26-loxP-STOP-loxP-GOI為例):

    • 5'同源臂 + loxP-STOP-loxP + GOI + 3'同源臂 + 篩選標記(如Neo)。

B. 基因編輯方法

  1. CRISPR-Cas9介導的KI

    • 設計sgRNA靶向插入位點,與供體載體共注射至受精卵。

    • 供體載體:包含同源臂和條件性表達盒(如圖1)。

  2. ES細胞打靶(傳統方法)

    • 電轉ES細胞后篩選陽性克隆,顯微注射至囊胚。

C. 小鼠品系建立

  1. Founder小鼠鑒定

    • PCR或Southern blot驗證正確整合。

  2. 與Cre品系交配

    • 例如:Rosa26-lsl-GOI × αMHC-Cre → 心臟特異性GOI表達。


3. 驗證與表型分析

A. 基因型驗證

  • PCR:檢測loxP位點、GOI插入及Cre重組效率。

  • 測序:確認無脫靶突變。

B. 表達驗證

  • qRT-PCR/Western blot:檢測GOI在心臟中的表達水平。

  • 免疫熒光/組織染色:定位GOI表達(如tdTomato熒光)。

C. 功能表型

  • 心臟功能:超聲心動圖(EF%、FS%)、心電圖(心律失常)。

  • 病理分析:心肌纖維化(Masson)、 hypertrophy(WGA染色)。


4. 常見問題與優(yōu)化

A. 低重組效率

  • 解決:優(yōu)化Cre品系(如高表達αMHC-Cre)或使用誘導型Cre(他mo昔芬)。

B. 背景泄漏表達

  • 優(yōu)化:加強STOP序列(如三重polyA信號)或選擇更嚴格的啟動子。

C. 脫靶效應

  • 解決:全基因組測序(WGS)篩選Founder小鼠。


5. 應用示例

案例1:心臟特異性表達熒光報告基因

  • 構建:Rosa26-lsl-tdTomato × αMHC-Cre → 心肌細胞紅色熒光標記。

  • 用途:追蹤心肌細胞譜系或移植細胞命運。

案例2:條件性激活突變基因

  • 構建:Knock-in loxP-STOP-loxP-mutant-Kras × cT*T-Cre → 心肌特異性致癌突變模型。


6. 注意事項

  1. 對照設計

    • 必須包括:無Cre的GOI小鼠(loxP-STOP-loxP-GOI)、Cre單獨表達小鼠。

  2. 時間控制

    • 誘導型Cre(如Cre-ERT2)需優(yōu)化他mi昔芬劑量和時間窗口。

  3. 倫理與標準化

    • 遵循ARRIVE指南,確保動物福利和實驗可重復性。



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