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    實(shí)驗(yàn)檢測(cè)助手——質(zhì)粒圖譜如何“瞅”

    發(fā)布時(shí)間: 2021-01-29  點(diǎn)擊次數(shù): 4061次

    每當(dāng)拿到一個(gè)質(zhì)粒圖譜,是不是一下就有點(diǎn)懵了?這些ori、RBS、tet是什么?這些箭頭代表什么,轉(zhuǎn)錄的方向嗎?不要著急,劍鈍生物把這些告訴你,也許會(huì)解決你的困惑。

    質(zhì)粒和載體傻傻分不清楚
    質(zhì)粒(Plasmid)是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子(即細(xì)胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型。

    載體即要把一個(gè)有用的基因(目的基因——研究或應(yīng)用基因)通過基因工程手段送到生物細(xì)胞(受體細(xì)胞),需要運(yùn)載工具(交通工具)攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞,這種運(yùn)載工具就叫做載體(vector)。細(xì)菌或病毒質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。

    簡(jiǎn)而言之,質(zhì)粒可以說是一個(gè)統(tǒng)稱,載體是質(zhì)粒改造過用來運(yùn)載的工具

    選用質(zhì)粒做載體的要求
    以常用的為例
    (1)選分子量小的質(zhì)粒,即小載體(1-1.5kb)→不易損壞,在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體);
    (2)一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束,一般 10 個(gè)以上的拷貝,而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10 個(gè)。
    (3)必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn),有選擇的余地;
    (4)必需有易檢測(cè)的標(biāo)記,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr。
    無論選用哪種載體,先都要獲得載體分子,然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割,獲得分子,以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。

    如何一眼看穿質(zhì)粒圖譜
    ①  復(fù)制起始位點(diǎn)Ori,了解質(zhì)粒的類型(原核/真核/穿梭質(zhì)粒),Ori的箭頭指復(fù)制方向,其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向(正向)。

    ②  再看篩選標(biāo)記,如抗性,決定使用什么篩選標(biāo)記:
    Ampr:水解β-內(nèi)酰胺環(huán),解除氨芐的毒性。
    tetr :可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
    camr:生成氯霉素羥乙?;苌铮怪ザ拘?。
    neor(kanr):氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。
    hygr:使潮霉素β失活。

    ③  看多克隆位點(diǎn)(MCS):它具有多個(gè)限制內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)(質(zhì)粒上只能有該內(nèi)切酶的*酶切序列,不然就一刀好幾段了),便于咱們要研究的基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入,會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活,而便于篩選,常見的是β-半乳糖苷酶的藍(lán)白斑篩選系統(tǒng)。

    ④再看外源DNA插入片段大?。嘿|(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA的片段。一般來說,外源DNA的片段越長(zhǎng),越難插入,越不穩(wěn)定,轉(zhuǎn)化效率越低。

    ⑤ 是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件,即啟動(dòng)子(promoter)-核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(AATAAA同時(shí)是poly A)。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體??寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體,還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

    ⑥看報(bào)告基因:主要是為了能迅速檢查功能基因是否表達(dá)的陽性判斷,表達(dá)成功的蛋白在小鼠體內(nèi)分布位置。
     
    ⑦看質(zhì)粒圖譜上的箭頭:它代表DNA兩條鏈(正義鏈和反義鏈),即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA,它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上,而它的抗性基因在另一條鏈上。
    目的基因片段進(jìn)行連接。

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